长链非编码 RNANKILA 在颈动脉狭窄中的临床价值及生物学机制研究
长链非编码 RNANKILA 在颈动脉狭窄中的临床价值及生物学机制研究
余春
邵思琪
景德镇市第三人民医院
神经内科
江西景德镇 333000
课题类别：江西省卫生健康委科技计划
项目编号：SKJP220226109
【摘要】目的：研究长链非编码 RNANKILA 在颈动脉狭窄（CAS）中的临床价值及生物学机
制。方法：纳入我院 2019 年 1 月至 2021 年 5 月期间收治的 80 例无症状 CAS 患者，纳入研
究组，选择同期于我院接受健康体检的 80 例年龄在 50-80 岁之间的健康受检者纳入对照组。
均进行 NKILA 表达水平检测，同时通过 CCK-8 检测细胞增殖，Transwell 小室实验检测细胞迁
移，测定炎症因子水平，并通过 Western blot 检测蛋白水平。结果：研究组血浆 NKILA 的相
对表达量低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。ROC 曲线分析显示，血浆 NKILA 表达
水平诊断颈动脉狭窄的曲线下面积（AUC）为 0.842。NKILA 过表达时，增殖能力高于 NKILA
沉默，迁移细胞数少于 NKILA 沉默，TNF-α、IL-6 水平低于 NKILA 沉默，差异有统计学意义
（P＜0.05）。Western blot 结果显示，NKILA 过表达 VSMCs 中 p-IκBα和核内 p65 蛋白表达
水平显著降低，胞浆中 p65 蛋白表达水平显著升高，NKILA 沉默则呈现相反趋势，p-IκBα
和核内 p65 蛋白表达水平显著升高，而胞浆中 p65 蛋白表达水平显著降低，差异有统计学
意义（P＜0.05），提示 NKILA 通过 NF-κB 信号通路调控 VSMCs 功能。结论：NKILA 在颈动
脉狭窄患者血浆中的表达水平显著降低，具有较高的潜在诊断价值。NKILA 能够抑制血管平
滑肌细胞的增殖、迁移和炎症因子分泌，并抑制 NF-κB 信号通路的激活，调控血管平滑肌
细胞功能。
【关键词】颈动脉狭窄；长链非编码 RNA；NKILA；生物学机制
颈动脉粥样硬化性狭窄即颈部大动脉血管管壁变窄，颈动脉狭窄（carotid artery stenosis，
CAS）疾病本身不具有死亡风险，但因颈动脉狭窄诱发的缺血性疾病，会对人体造成较大的
死亡威胁[1]。伴随颈动脉狭窄程度的增加，脑卒中的发病风险也逐步增加[2]。颈动脉狭窄的
发病机制与血管平滑肌细胞异常增殖、迁移及炎症反应等多种因素密切相关[3]。长链非编码
RNA NKILA（NF-κB Interacting LncRNA）是一类位于染色体 20q13 的重要非编码 RNA 分子，
主要通过特异性调控 NF-κB 信号通路，进行多种心血管疾病病理生理过程的参与。研究表明，
NKILA 能够通过物理遮挡 IκB 的磷酸化位点，抑制 IKK 对 IκB 的磷酸化一剂 NF-κB 通路的激活，
实现炎症反应调控。在颈动脉狭窄的进展过程中，NF-κB 信号通路的异常激活会导致血管平
滑肌细胞表型转换，从收缩型转变为合成型，进而表现出增强的增殖、迁移和分泌能力，促
进动脉粥样硬化斑块形成和血管重塑。本研究结合部分临床资料，就 NKILA 在颈动脉狭窄中
的表达变化及其临床价值进行探索，分析其生物学机制，为颈动脉狭窄的早期诊断与干预提
供部分思路。
1 资料与方法
1.1、一般资料：纳入我院 2019 年 1 月至 2021 年 5 月期间收治的 80 例无症状 CAS 患者，纳入标准：年龄在 50-80 岁之间；根据患者临床数据和美国国立卫生研究院卒中量表确定为
无症状 CAS；通过彩色多普勒超声确诊颈动脉狭窄程度≥50％。排除标准：既往中风病史；
既往短暂性脑缺血发作者；伴冠状动脉不稳定；伴充血性心力衰竭；合并慢性或急性炎症；
确诊癌症者；近期颅内出血者；伴吸烟饮酒史。纳入研究组，选择同期于我院接受健康体检
的 80 例年龄在 50-80 岁之间的健康受检者纳入对照组。研究组中男性 45 例，女性 35 例，
年龄 50~80（66.59±6.52）岁，对照组中男性 42 例，女性 38 例，年龄 50~80（67.23±7.13）
岁，两组性别、年龄等一般资料对比无统计学意义（P＞0.05）。
1.2、方法
1.2.1、样本采集与处理：于患者入院当天采集血样，室温下 2500r/min 离心处理 15min，收
集血清样品，并在-80°C 下储存。
1.2.2、NKILA 表达水平检测：采用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测受试者血清的 NKILA 水
平。通过 TRIzol 试剂提取总 RNA，NanoDrop 测定 RNA 浓度和纯度，A260/A280 比值在 1.8-2.0
之间。使用逆转录试剂盒将 RNA 逆转录为 cDNA，以 GAPDH 为内参基因，采用 SYBR Green
法 进 行 qRT-PCR 检 测 。 NKILA 引 物 序 列 ： 上 游 5′-CAGGTCAAGGTCAGGTCAAG-3′ ， 下 游
5′-TGGTCACAGTCTGGTCACAG-3’；GAPDH 引物序列：上游 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，
下游 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。反应条件：95℃预变性 5min；95℃变性 30s，60℃
退火 30s，72℃延伸 30s，共 40 个循环。在此基础上，通过 2^(-ΔΔCt)法计算 NKILA 的相对表
达量。
1.2.3、细胞培养和转染：VSMC 购自美国典型培养物保藏中心，并在含有 10％ 胎牛血清
(Thermo Fisher Scientific, Inc.) 的 Dulbecco 改 良 Eagle 培 养 基 (Gibco; Thermo Fisher
Scientific, Inc.) 中培养。将细胞在 37°C 和 5％ CO 2 的培养箱中培养。当细胞达到 60％融
合度时进行细胞转染。
1.2.4、CCK-8 检测细胞增殖：将转染后指数生长期的 VSMC 以每孔 5×104 个细胞接种在 96
孔板中连续培养 3 天，并在 0、24、48 或 72 小时测定其增殖能力。检测前，每孔加入 10 µl
Cell Counting kit 8 (CCK-8) 试剂，继续孵育 1 h。通过 Bio-Rad iMark 读板器在 490 nm 处检
测吸光度值。
1.2.5、Transwell 小室实验检测细胞迁移：使用 8 um 孔径(美国康宁公司)的 Transwell 小室测
试 VSMCs 的迁移能力。转染后的细胞在无血清培养基中制备成细胞悬液，在 Transwell 室的
上腔接种×104 个细胞/孔，下腔加入 500 μl 含 10％胎牛血清的培养基。在培养箱中培养
24 h，用棉签擦拭上腔未迁移的细胞，4％多聚甲醛固定 10 min，结晶紫染色 20 min。在显
微镜下随机选取 5 个视野进行计数，检测 VSMCs 迁移能力的变化。
1.2.6、炎症因子水平测定：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清液中肿瘤坏
死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）的水平。
1.2.7、Western blot 检测蛋白水平：4℃下加入 RIPA 试剂裂解 60 分钟。离心收集上清裂解液，
BCA 蛋白测定测定浓度。取 25 微克蛋白在 80 V 下电泳 120 min，然后将蛋白在 90 V 下转移
到 PVDF 膜上 100 min，封闭 2 h 后在 4℃下与一抗孵育过夜。用 TBST 溶液冲洗膜 3 次，10
分钟，与辣根过氧化物偶联二抗（山羊抗小鼠 IgG，1:2000，Proteintech;山羊抗兔 IgG,1:2000，
Proteintech)）室温孵育 2 h。用 TBST 洗膜 3 次后，用化学发光检测试剂盒对蛋白条带进行可
视化 ,用 Image J 软件对其光密度进行定量。
1.2.8、随访结果收集：对所有 CAS 患者及健康对照组人员进行 5 年随访。
1.3、统计学方法
数据采用 SPSS 20.0 统计学软件处理，计量资料用（ x s ）表示，采用 t 检验，计数资料用[n(％)]表示，采用 2检验，采用 ROC 曲线评估 NKILA 对颈动脉狭窄的诊断价值，P＜0.05
说明差异存在统计学意义。
2 结果
2.1、两组 NKILA 表达情况对比及 NKILA 在 CAS 中的诊断价值：对照组血浆 NKILA 的相对表
达量为（1.01±0.21），研究组为（0.52±0.18），研究组血浆 NKILA 的相对表达量低于对照组，
差异有统计学意义（P＜0.05）。ROC 曲线分析显示，血浆 NKILA 表达水平诊断颈动脉狭窄的
曲线下面积（AUC）为 0.842（95％CI：0.782-0.902），最佳截断值为 0.681 时，敏感度为 78.32％，
特异度为 85.04％。
2.2、NKILA 对 VSMCs 功能、VSMCs 炎症因子分泌的影响：NKILA 过表达时，增殖能力高于
NKILA 沉默，迁移细胞数少于 NKILA 沉默，TNF-α、IL-6 水平低于 NKILA 沉默，差异有统计
学意义（P＜0.05），见表 1。
表 1 NKILA 对 VSMCs 功能、VSMCs 炎症因子分泌的影响（ x s ）
NKILA 表达情
况
例数
增殖能力
（OD490nm，
72h）
迁移细胞数（个
/视野）
TNF-α（pg/ml） IL-6（pg/ml）
NKILA 过表达
42
0.62±0.07
42.31±5.66
65.43±8.25
52.62±6.83
NKILA 沉默
38
1.28±0.13
105.72±11.33
186.17±21.39
152.45±18.64
t
28.643
32.124
33.918
32.405
P
＜0.001
＜0.001
＜0.001
＜0.001
2.3、NKILA 通过 NF-κB 信号通路调控 VSMCs 功能的机制分析：Western blot 结果显示，NKILA
过表达 VSMCs 中 p-IκBα和核内 p65 蛋白表达水平显著降低，胞浆中 p65 蛋白表达水平显
著升高，NKILA 沉默则呈现相反趋势，p-IκBα和核内 p65 蛋白表达水平显著升高，而胞浆
中 p65 蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），提示 NKILA 通过 NF-κB 信
号通路调控 VSMCs 功能。见表 2。
表 2 NKILA 通过 NF-κB 信号通路调控 VSMCs 功能的机制分析（ x s ）
NKILA 表达情
况
例数
胞浆 p65
核内 p65
IκBα
p-IκBα
NKILA 过表达
42
1.35±0.14
0.42±0.05
1.28±0.13
0.38±0.04
NKILA 沉默
38
0.65±0.07
1.56±0.16
0.72±0.08
1.48±0.15
t
27.824
43.893
22.911
45.788
P
＜0.001
＜0.001
＜0.001
＜0.001
3 讨论
颈动脉狭窄的发生与动脉粥样硬化密切相关，研究发现，血管平滑肌细胞的异常增殖与
迁移是颈动脉狭窄发生发展的关键。正常生理状态下，血管平滑肌细胞维持血管张力与结构
的稳定性，而受到病理因素影响，会发生表型转换，从收缩型转变为合成型，进而出现增强
的增殖、迁移和分泌能力，促进动脉粥样硬化斑块形成及血管重塑。NF-κB 通常以二聚体
形式存在，静息状态下会与抑制蛋白 IκB 结合形成复合物，以非活性形式存在于细胞质中。
但受到刺激时，如促炎细胞因子等，IκB 激酶复合物被激活，会导致 IκB 磷酸化并被蛋白
酶体降解，促使 NF-κB 转位至细胞核，进而与特定的 DNA 序列结合[4]。
本研究分析了长链非编码 RNANKILA 在颈动脉狭窄中的临床价值及生物学机制，发现研究组血浆 NKILA 的相对表达量低于对照组，提示 NKILA 可作为颈动脉狭窄的诊断和预后评估
生物标志物。ROC 曲线分析显示，血浆 NKILA 表达水平诊断颈动脉狭窄的 AUC 为 0.842，具
有较高的诊断价值。同时本研究发现，NKILA 过表达时，增殖能力高于 NKILA 沉默，迁移细
胞数少于 NKILA 沉默，TNF-α、IL-6 水平低于 NKILA 沉默，提示 NKILA 通过抑制血管平滑肌
细胞的异常增殖和迁移，减轻炎症反应，从而在颈动脉狭窄的发生发展中发挥保护作用。在
颈动脉狭窄过程中，NF-κB 信号通路的激活可诱导多种促炎症细胞因子的产生，如 IL-6 和
TNF-α，这些因子与动脉粥样硬化炎症、内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞增殖等过程密切相
关。
Western blot 结果显示，NKILA 过表达 VSMCs 中 p-IκBα和核内 p65 蛋白表达水平显著
降低，胞浆中 p65 蛋白表达水平显著升高，NKILA 沉默则呈现相反趋势，p-IκBα和核内 p65
蛋白表达水平显著升高，而胞浆中 p65 蛋白表达水平显著降低，证实了 NKILA 通过 NF-κB
信号通路调控血管平滑肌细胞功能。NKILA 具有保守的二级结构，能够在细胞质中与 NF-κB
信号通路的关键蛋白直接相互作用，尤其是与 p65/IκB 复合物结合，通过物理遮挡 IκB 的
磷酸化位点，从而抑制 IKK 对 IκB 的磷酸化及 NF-κB 通路的激活[5]。
综上所述，在颈动脉狭窄患者血浆中 NKILA 表达水平显著降低，且与疾病严重程度相关，
具有较高的潜在诊断价值。NKILA 能够抑制血管平滑肌细胞的增殖、迁移和炎症因子分泌，
同时通过抑制 NF-κB 信号通路的激活，调控血管平滑肌细胞功能。
参考文献
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